基因克隆是指在體外將含有目的基因或其它有意義的DNA片段同能夠自我復制的載體DNA連接，然后將其轉入宿主細胞或受體生物進行表達或進一步研究的分子操作的過程，因此基因克隆又稱DNA克隆、分子克隆、基因重組或重組DNA技術。基因克隆涉及一系列的分子生物學技術，如目的DNA片段的獲得、載體的選擇、各種工具酶的選用、體外重組、導入宿主細胞技術和重組子篩選技術等等。為了方便大家學習和交流，我以問答形式介紹基因克隆及其常見問題，希望對大家有所幫助。Q1：如何獲取一個已知基因的序列？A1：...

1雜交溶液或洗滌溶液在使用前未預熱2探針濃度過高或探針未變性。將雜交液裝入雜交管時，體積減少，探針濃度發生了變化，應確保相應地調整探針濃度。3未從探針溶液中去除未結合核苷酸。4預雜交和雜交溶液中的預雜交或阻斷劑不足，充分的預雜交對于阻止膜的非特異性雜交非常重要。5雜交或洗脫條件不夠嚴格：6降低鹽濃度。7提高溫度。8增加SDS的濃度。9增加洗脫次數。10膜太干燥，這通常可能是明顯重疊問題的原因，可能由以下原因引起：11探針體積太小。溶液更換速度太慢，尤其是批量更換處理時分子雜交...

1放射自顯影期間膜對膠片的曝光時間不足。2核酸轉移或結合在尼龍膜上的效率低3目標序列以非常低的拷貝數存在。增加加載到凝膠上的樣品量。4沒有足夠數量的探針序列，增加探針的濃度或加入10%硫酸葡聚糖，這樣減少了溶劑體積，可以到到相同的效果。5沒有探針同源性。6雙鏈DNA探針未變性，或者，探針檢測儀性能下降。在使用RNA探針時發生可能更大。7探針的比活性太低。考慮諸如標記反應中的探針濃度、放射性標記的三磷酸鹽的半衰期等因素。8雜交和/或洗滌過程中試驗方法不佳：1）增加鹽的濃度。2）...

常見問題Q1：標記方法有哪幾種？A1：（1）切口平移法（2）隨機引物法（3）末端標記法（4）單鏈DNA探針標記（5）寡核苷酸探針標記法Q2：探針標記物的分類有幾種？A2：（1）探針標記物有放射性核素與非放射性物質兩種。放射性核素標記敏感性高，可檢測pg水平的核酸，但因不易長期保存，且存在放射性污染等問題，現已較少應用。（2）非放射性物質常用的有生物素、地高X等，非放射性探針安全、穩定、操作方便并且經濟，但敏感性較低，近年來，由于雜交信號檢測方法的改進，檢測的敏感性得到了很大提...

核酸雜交(Nucleicacidhybridization)，又稱核酸分子雜交。威尼德分子雜交儀原理：是核酸變性和復性理論。雙鏈的核酸分子在某些理化因素作用下雙鏈解開形成單鏈，當理化因素消除后，具一定同源性的兩條(探針和待測核苷酸序列)單鏈在適宜的溫度及離子強度條件下，可按堿基互補配對原則特異性地復性形成雙鏈。核酸分子雜交可在DNA與DNA、RNA與RNA或RNA與DNA的二條單鏈之間進行。分類：核酸分子雜交按作用環境不同分為固相核酸分子雜交和液相核酸分子雜交。一、固相核酸分...

硝酸纖維素膜(nitrocellulosefiltermembrane，簡稱NC膜)，NC膜在NorthernBlot、SouthernBlot、WesternBlot中都需要用到，雜交技術有固相雜交和液相雜交之分。固相雜交技術目前較為常用，先將待測核酸結合到一定的固相支持物上，再與液相中的標記探針進行雜交。固相支持物常用硝酸纖維素膜。PVDF膜即聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidenefluoride）是蛋白質印跡法中常用的一種固相支持物。PVDF膜是疏水性的，膜孔徑有...

Q1:PVDF膜和硝酸膜結合蛋白的原理是什么？A1:一般而言，硝酸纖維素膜是通過疏水作用來和蛋白質相聯，若反復洗幾次后，蛋白容易掉下來，效果較差。尼龍膜主要通過它膜上的正電荷和蛋白接合（注：常用的PVDF膜即帶正電荷的尼龍膜），同時也有疏水作用，但相對較弱。這樣的話，PVDF膜和蛋白接合較牢，不易脫落，效果較好。Q2:做組織樣品的westernblot的時候，處理樣品有什么訣竅？A2:必須進行研磨、勻漿、超聲處理，蛋白質溶解度會更好，離心要充分，膜蛋白需用更劇烈的方法抽提，低...

經典實驗步驟是將提取的蛋白電泳—轉膜---一抗孵育---二抗孵育---底物顯色---分析。我這幾天幾乎都在重復著這個過程，現在將自己試驗過程記錄下來，和大家一起分享，希望對新手有所幫助。1.蛋白提取傳統方法是(1)組織稱重(2)利用液氮、研缽粉碎組織塊(3)加入RIPA緩沖液，PMSF(4)勻漿（15,000轉/分*1分鐘）維持4℃(5)加入PMSF冰上孵育30分鐘，移入離心管4℃離心15分鐘(6)上清液為細胞裂解液可分裝-20℃保存。一部分進行Bradford比色法測定蛋白...