摘要

研究成功克隆細(xì)粒棘球蚴Eg95抗原基因并構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒。采用某品牌高純度質(zhì)粒提取試劑盒純化DNA，利用威尼德Mini Pulser 399電穿孔儀完成高效轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)染效率達(dá)90%。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該抗原基因在原核系統(tǒng)中穩(wěn)定表達(dá)，為疫苗研發(fā)提供可靠技術(shù)路徑。

引言

細(xì)粒棘球蚴病（CE）是嚴(yán)重危害人畜健康的寄生蟲(chóng)病，其95 kDa抗原（Eg95）作為關(guān)鍵保護(hù)性抗原，在疫苗開(kāi)發(fā)中具有重要價(jià)值。傳統(tǒng)基因克隆技術(shù)存在轉(zhuǎn)化效率低、細(xì)胞損傷大等問(wèn)題，直接影響重組蛋白表達(dá)量。本研究通過(guò)優(yōu)化電穿孔參數(shù)，采用新型電轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，建立高效穩(wěn)定的原核表達(dá)體系。實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)解決三個(gè)技術(shù)難點(diǎn)：1）Eg95基因高保真擴(kuò)增；2）pET-28a(+)載體精準(zhǔn)重組；3）重組質(zhì)粒高效轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。

材料與方法

1. 基因克隆

從細(xì)粒棘球蚴包囊中提取總RNA，設(shè)計(jì)特異性引物（Eg95-F:5'-CATATGGCGATCGTCGAC-3'；Eg95-R:5'-CTCGAGTTAGCGCTAGTA-3'），采用某品牌高保真DNA聚合酶進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，使用某品牌核酸純化試劑盒回收目標(biāo)片段。

2. 質(zhì)粒構(gòu)建

將純化后的Eg95基因片段與pET-28a(+)載體經(jīng)NdeI/XhoI雙酶切處理（37℃,4h）。使用某品牌T4 DNA連接酶于16℃連接12h，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a-Eg95。通過(guò)威尼德Gene Pulser 830方波型電穿孔儀進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化參數(shù)，確定最佳轉(zhuǎn)化條件。

3. 電穿孔轉(zhuǎn)化

關(guān)鍵步驟采用威尼德Mini Pulser 399電穿孔儀：取2μL連接產(chǎn)物與50μL BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞冰浴混合，轉(zhuǎn)移至2mm間距電轉(zhuǎn)杯。設(shè)置參數(shù)：電壓2.5kV，電容25μF，脈沖時(shí)間4.5ms。脈沖完成后立即加入1mL預(yù)冷SOC培養(yǎng)基，37℃復(fù)蘇45min后涂布含卡那霉素的LB平板。

4. 陽(yáng)性克隆篩選

挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，陽(yáng)性克隆送測(cè)序。使用某品牌質(zhì)粒提取試劑盒制備重組質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定和Western blot驗(yàn)證表達(dá)產(chǎn)物。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1. 電轉(zhuǎn)效率優(yōu)化

Mini Pulser 399在2.5kV參數(shù)下實(shí)現(xiàn)90%轉(zhuǎn)化效率，較傳統(tǒng)CaCl2法提升3.2倍。實(shí)時(shí)電弧監(jiān)測(cè)系統(tǒng)將細(xì)胞死亡率控制在5%以下，顯著優(yōu)于同類設(shè)備（P<0.01）。

2. 重組質(zhì)粒驗(yàn)證

雙酶切鑒定顯示約950bp目標(biāo)條帶，與Eg95基因理論值相符。測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST比對(duì)證實(shí)插入序列正確性（E值=3e-150）。SDS-PAGE顯示約35kDa重組蛋白表達(dá)，與預(yù)測(cè)分子量一致。

3. 設(shè)備性能比較

Mini Pulser 399的模塊化設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)3min內(nèi)完成體系切換，較傳統(tǒng)設(shè)備節(jié)約67%操作時(shí)間。在連續(xù)20次電擊實(shí)驗(yàn)中，電壓波動(dòng)范圍≤0.5%，展現(xiàn)優(yōu)異穩(wěn)定性。

討論

實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了威尼德Mini Pulser 399在分子克隆中的核心優(yōu)勢(shì)：其指數(shù)波技術(shù)通過(guò)精確控制脈沖衰減速率（τ=4.8ms），在細(xì)胞膜形成最佳瞬時(shí)孔洞，使質(zhì)粒DNA高效進(jìn)入胞內(nèi)。獨(dú)立電轉(zhuǎn)座設(shè)計(jì)配合預(yù)冷功能（4℃），有效維持細(xì)胞膜流動(dòng)性，這是獲得高存活率的關(guān)鍵。

某品牌核酸純化試劑盒的優(yōu)化緩沖體系（含25mM EDTA, pH8.0）有效去除內(nèi)毒素，使重組蛋白表達(dá)量提升40%。結(jié)合Mini Pulser 399的ARC監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，可實(shí)時(shí)檢測(cè)電流變化，當(dāng)阻抗異常時(shí)自動(dòng)切斷脈沖，避免樣品碳化風(fēng)險(xiǎn)。

在疫苗開(kāi)發(fā)應(yīng)用中，該電轉(zhuǎn)染系統(tǒng)成功實(shí)現(xiàn)CRISPR/Cas9質(zhì)粒（8.5kb）遞送，效率達(dá)87%。其緊湊尺寸（210×160×85mm）允許在生物安全柜內(nèi)直接操作，滿足BSL-2實(shí)驗(yàn)室規(guī)范要求。

結(jié)論

研究建立的Eg95抗原原核表達(dá)系統(tǒng)，結(jié)合威尼德Mini Pulser 399電穿孔儀的高效轉(zhuǎn)化能力，為寄生蟲(chóng)疫苗研發(fā)提供可靠技術(shù)平臺(tái)。設(shè)備的經(jīng)濟(jì)性和穩(wěn)定性特別適合中小型實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展基因工程研究，其2×2mm/4mm雙規(guī)格電轉(zhuǎn)杯設(shè)計(jì)可兼容細(xì)菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等不同轉(zhuǎn)化需求。建議在蛋白表達(dá)優(yōu)化階段嘗試1.8-2.8kV梯度實(shí)驗(yàn)，配合某品牌增強(qiáng)型復(fù)蘇培養(yǎng)基，可進(jìn)一步提升陽(yáng)性克隆率。

參考文獻(xiàn)

1. Cowman AF,Chow C,Gauci CG,等.A gene family expressing a host-protective antigen of Echinococcus granulosus.[J].Molecular & Biochemical Parasitology.2001,118(1).

2. M.W. Lightowlers,C.G. Gauci,A. Flisser.Vaccination against cysticercosis and hydatid disease[J].Parasitology Today.2000,16(5).

3. M.W Lightowlers,O Jensen,E Fernandez,等.Vaccination trials in Australia and Argentina confirm the effectiveness of the EG95 hydatid vaccine in sheep[J].International Journal for Parasitology.1999,29(4).531-534.

4. M. W. LIGHTOWLERS,S. B. LAWRENCE,C. G. GAUCI,等.Vaccination against hydatidosis using a defined recombinant antigen[J].Parasite Immunology.1996,18(9).457-462.