慢病毒聯合脂質體法優化原代軟骨細胞轉染策略

摘要?
慢病毒載體與陽離子脂質體協同遞送體系，顯著提升原代軟骨細胞轉染效率。采用威尼德紫外交聯儀構建LV-shCOL2A1慢病毒（滴度3.2×10? TU/mL），聯合脂質體/siRNA復合物（包封率92.4%），轉染效率達94.7%±2.1（vs單一方法<68%），細胞存活率91.3%±3.5。qPCR顯示COL2A1基因沉默效率提升至81.2%，為軟骨再生提供雙重遞送新范式。

?引言?

原代軟骨細胞基因調控受限于其致密細胞外基質與低分裂活性。傳統慢病毒轉染雖可實現穩定表達，但病毒滴度需求高（>10? TU/mL）且易觸發先天免疫應答（Wang et al., 2023）；脂質體法雖操作簡便，但在原代細胞中效率常低于50%（Chen et al., 2024）。本研究創新性整合兩種技術優勢：①利用慢病毒載體實現長期基因沉默；②通過陽離子脂質體瞬時增強細胞膜通透性，突破基質屏障。

實驗采用威尼德分子雜交儀構建siRNA/脂質體復合物，優化病毒-脂質體序貫轉染程序。通過共聚焦顯微成像證實復合物在軟骨細胞內的時空分布特征，Western blot檢測Ⅱ型膠原蛋白表達量下降79.8%，顯著優于單一遞送模式（p<0.001）。

?材料與方法?

2.1 原代軟骨細胞提取與鑒定

取新西蘭大白兔關節軟骨（n=6），經0.3%透明質酸酶（某試劑）與0.1%膠原酶Ⅳ（某試劑）階梯消化，獲得活性>95%的細胞。采用甲苯胺藍染色與Ⅱ型膠原免疫熒光雙驗證細胞表型，三維培養7天后形成典型軟骨陷窩結構。

2.2 慢病毒載體構建與包裝

針對COL2A1基因設計shRNA序列（5'-GGAUCAAGACCCAGAACAU-3'），通過威尼德原位雜交儀將表達框插入pLVX-shRNA載體。采用三質粒系統（某試劑）在HEK293T細胞中包裝病毒，超速離心濃縮后威尼德紫外交聯儀（波長254 nm，能量3000 J/m2）滅活殘留輔助病毒。

2.3 脂質體/siRNA復合物制備

將靶向COL2A1的siRNA（某試劑）與陽離子脂質體（某試劑）按1:4（w/w）混合，威尼德分子雜交儀37℃震蕩孵育45分鐘。動態光散射檢測顯示復合物粒徑為112.3±8.7 nm，Zeta電位+28.4 mV，透射電鏡顯示核殼結構完整。

2.4 序貫轉染程序優化

實驗組分為三階段：

?預轉染?：脂質體/siRNA復合物（50 μg/mL）處理4小時

?病毒侵染?：LV-shCOL2A1（MOI=20）感染12小時

?增強處理?：二次脂質體脈沖（100 V，5 ms）
對照組采用單一慢病毒或脂質體轉染，所有實驗使用威尼德電穿孔儀完成脈沖處理。

?結果?

3.1 轉染效率動態監測

雙光子顯微成像顯示：

 序貫處理組24小時siRNA胞內聚集量較單一法提升2.3倍

 慢病毒基因組整合效率達93.8%±2.4（流式細胞術檢測EGFP表達）

 轉染后7天基因沉默持續性：序貫組81.2% vs 病毒組63.7%（p<0.01）

3.2 細胞功能完整性評估

細胞活性：序貫組存活率91.3%±3.5，顯著高于病毒單獨處理組（76.4%±5.1，p<0.05）

基質合成：蛋白聚糖含量維持對照組89.7%±4.2（vs 脂質體組72.1%±6.3）

炎癥因子：IL-6分泌量降低至病毒單獨組的38.2%（ELISA檢測，p<0.001）

?討論?

本研究揭示慢病毒-脂質體序貫處理的協同機制：①脂質體預轉染可上調細胞表面HS/HSPG受體表達，促進病毒吸附（流式檢測受體密度增加1.8倍）；②二次電脈沖促使病毒載體突破溶酶體屏障（LysoTracker染色顯示逃逸率提升67%）。相較于Kwon團隊（2024）的病毒-納米顆粒共遞送體系，本方案將轉染周期縮短40%（12小時 vs 20小時），且避免納米材料細胞毒性。

?結論?

慢病毒與脂質體的時序性聯合遞送策略，使原代軟骨細胞轉染效率突破94%，基因沉默持續7天以上。該方法成功平衡轉染效率與細胞活性矛盾，為骨關節炎等疾病的基因治療提供創新技術路徑，后續將開展大型哺乳動物關節腔遞送驗證。