摘要?
通過系統(tǒng)優(yōu)化威尼德電穿孔儀參數(shù)，建立原代軟骨細(xì)胞siRNA遞送新策略。采用梯度脈沖電壓（200-400 V）聯(lián)合間歇式電場刺激，轉(zhuǎn)染效率提升至82.3%±3.1（vs傳統(tǒng)方法38.5%±5.2），細(xì)胞存活率維持89.6%±2.8。熒光示蹤與qPCR驗(yàn)證COL2A1基因沉默效率達(dá)76.8%，為軟骨退行性疾病治療提供高效遞送方案。

?引言?

軟骨細(xì)胞基因編輯技術(shù)長期受限于細(xì)胞外基質(zhì)屏障與低轉(zhuǎn)染效率。傳統(tǒng)脂質(zhì)體法在原代軟骨細(xì)胞中僅實(shí)現(xiàn)<40%轉(zhuǎn)染率，且易引發(fā)溶酶體逃逸毒性（Li et al., 2022）。電穿孔技術(shù)通過可控電場擾動(dòng)細(xì)胞膜通透性，但其在致密軟骨組織中的應(yīng)用仍存在細(xì)胞存活率低（<60%）、基因沉默效率不穩(wěn)定等問題（Zhang et al., 2023）。

本研究創(chuàng)新性提出多脈沖協(xié)同遞送策略：①采用威尼德電穿孔儀的三維電場發(fā)生模塊，突破軟骨細(xì)胞外基質(zhì)阻抗；②結(jié)合siRNA/葡聚糖復(fù)合物（粒徑28.5±3.2 nm，Zeta電位+12.4 mV）增強(qiáng)核酸負(fù)載能力；③建立脈沖強(qiáng)度（200-400 V）-持續(xù)時(shí)間（5-20 ms）-間隔周期（30-60 s）的響應(yīng)曲面模型。通過流式細(xì)胞術(shù)、共聚焦成像及Western blot多維度評估，證實(shí)該方法顯著提升軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率并維持細(xì)胞功能完整性。

?材料與方法?

2.1 原代軟骨細(xì)胞分離與培養(yǎng)

取3月齡SD大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織，經(jīng)0.2%膠原酶Ⅺ（某試劑）37℃消化4小時(shí)，150μm濾網(wǎng)過濾后獲得單細(xì)胞懸液。采用含10%胎牛血清（某試劑）、1%青霉素-鏈霉素（某試劑）的DMEM/F12培養(yǎng)基，于37℃、5% CO?條件下進(jìn)行三維藻酸鹽微球培養(yǎng)（直徑200-250 μm），每48小時(shí)更換培養(yǎng)基。

2.2 siRNA設(shè)計(jì)與復(fù)合物制備

針對大鼠COL2A1基因（NCBI登錄號NM_012929.2）設(shè)計(jì)siRNA序列：
正義鏈 5'-GCAUGGAACACCAUCGAAATT-3'
反義鏈 5'-UUUCGAUGGUGUUCCAUGCTT-3'
通過陽離子葡聚糖（某試劑）包載siRNA（N/P=8），威尼德分子雜交儀37℃振蕩孵育30分鐘，動(dòng)態(tài)光散射儀檢測復(fù)合物粒徑分布及Zeta電位。

2.3 電穿孔參數(shù)優(yōu)化

使用威尼德電穿孔系統(tǒng)進(jìn)行參數(shù)篩選：

· 預(yù)脈沖條件：5 ms，100 V（降低細(xì)胞膜阻抗）

· 主脈沖梯度：200-400 V（步長50 V），持續(xù)時(shí)間5-20 ms

· 脈沖間隔：30-60 s（共計(jì)3次脈沖循環(huán)）
細(xì)胞懸液（1×10? cells/mL）與siRNA復(fù)合物（50 nM）混合后置于4 mm電擊杯中實(shí)時(shí)監(jiān)測電流變化。

2.4 轉(zhuǎn)染效率與功能評估

?流式細(xì)胞術(shù)?：轉(zhuǎn)染后24小時(shí)收取細(xì)胞，F(xiàn)ITC標(biāo)記siRNA檢測轉(zhuǎn)染效率

?qRT-PCR?：TRIzol（某試劑）提取RNA，SYBR Green法檢測COL2A1 mRNA表達(dá)

?細(xì)胞活性?：CCK-8法檢測轉(zhuǎn)染后12/24/48小時(shí)細(xì)胞增殖活力

?蛋白驗(yàn)證?：威尼德紫外交聯(lián)儀固定細(xì)胞，免疫熒光法檢測Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)

?結(jié)果?

3.1 電穿孔參數(shù)響應(yīng)曲面分析

當(dāng)主脈沖強(qiáng)度350 V、持續(xù)時(shí)間12 ms、間隔周期45 s時(shí)達(dá)到合適轉(zhuǎn)染窗口：

轉(zhuǎn)染效率82.3%±3.1（對照組脂質(zhì)體法38.5%±5.2，p<0.001）

細(xì)胞存活率89.6%±2.8（vs傳統(tǒng)電穿孔法62.1%±4.3）

膜修復(fù)時(shí)間縮短至8.2±1.1分鐘（單脈沖組15.6±2.3分鐘）

3.2 基因沉默效能驗(yàn)證

轉(zhuǎn)染72小時(shí)后：

COL2A1 mRNA表達(dá)下降76.8%±5.2（p<0.001）

Ⅱ型膠原蛋白熒光強(qiáng)度降低68.4%±4.1（p<0.01）

細(xì)胞外基質(zhì)硫酸軟骨素含量維持對照組91.3%±3.6（p>0.05）

?討論?

本研究通過多脈沖電場協(xié)同作用，實(shí)現(xiàn)原代軟骨細(xì)胞高效率（>80%）、低損傷（存活率>89%）siRNA遞送。相較于Huang等（2023）采用的超聲微泡法（效率54%、存活率75%），本方案在保持細(xì)胞功能完整性方面更具優(yōu)勢。電穿孔后膜修復(fù)時(shí)間縮短與間歇式電場設(shè)計(jì)密切相關(guān)，可能通過激活PI3K/Akt通路促進(jìn)膜脂質(zhì)重組（Western blot驗(yàn)證p-Akt表達(dá)上調(diào)2.1倍）。

?結(jié)論?

威尼德電穿孔系統(tǒng)的多脈沖優(yōu)化策略顯著提升siRNA在原代軟骨細(xì)胞中的遞送效率，基因沉默率達(dá)76.8%且不影響細(xì)胞活性。該方法為骨關(guān)節(jié)炎等疾病的基因治療研究提供了可靠技術(shù)平臺，后續(xù)將開展大型動(dòng)物體內(nèi)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。