摘要

研究基于電穿孔技術(shù)優(yōu)化真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染體系，采用威尼德Mini Pulser 399電穿孔儀驗(yàn)證其性能。實(shí)驗(yàn)表明，該設(shè)備通過(guò)高精度指數(shù)波脈沖與實(shí)時(shí)電弧監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)人胚腎HEK293細(xì)胞90%轉(zhuǎn)染效率，細(xì)胞存活率達(dá)85%以上，同步完成原核細(xì)胞與植物原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染驗(yàn)證，為多學(xué)科研究提供高效技術(shù)平臺(tái)。

引言

外源基因遞送效率是制約真核細(xì)胞功能研究的關(guān)鍵瓶頸。傳統(tǒng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法受限于細(xì)胞類(lèi)型特異性，病毒載體存在生物安全風(fēng)險(xiǎn)，而機(jī)械法轉(zhuǎn)染易導(dǎo)致細(xì)胞損傷。電穿孔技術(shù)憑借其物理穿透特性，逐漸成為跨物種基因遞送的主流方案。然而，現(xiàn)有設(shè)備普遍存在參數(shù)調(diào)試復(fù)雜、細(xì)胞存活率波動(dòng)大、多場(chǎng)景適配性不足等缺陷。研究通過(guò)系統(tǒng)評(píng)估威尼德Gene Pulser 830方波型電穿孔儀的升級(jí)產(chǎn)品——Mini Pulser 399，驗(yàn)證其在高通量基因編輯與蛋白表達(dá)研究中的技術(shù)優(yōu)勢(shì)。

實(shí)驗(yàn)部分

材料與方法

1.1 儀器配置

實(shí)驗(yàn)采用威尼德Mini Pulser 399電穿孔系統(tǒng)，配備0.4 cm間距電轉(zhuǎn)杯（貨號(hào)：EC-004）及2 mm微孔電轉(zhuǎn)杯（貨號(hào)：EC-002M）。脈沖發(fā)生器采用型雙極性方波技術(shù)，內(nèi)置32位數(shù)字信號(hào)處理器實(shí)時(shí)調(diào)控電場(chǎng)強(qiáng)度。

1.2 細(xì)胞系與載體

人胚腎HEK293細(xì)胞系培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒為pEGFP-N1（某試劑公司，5.6 kb）。植物原生質(zhì)體分離自擬南芥葉片，使用pHB-YFP載體（某試劑公司）進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)。

1.3 電轉(zhuǎn)參數(shù)優(yōu)化

建立三級(jí)參數(shù)驗(yàn)證體系：初級(jí)測(cè)試采用預(yù)設(shè)程序P3（電壓1200 V，脈寬5 ms），進(jìn)階測(cè)試根據(jù)細(xì)胞直徑（15-20 μm）調(diào)整電壓梯度（800-1500 V），終級(jí)測(cè)試結(jié)合細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（某品牌）數(shù)據(jù)優(yōu)化細(xì)胞密度（1×10^6 cells/mL）。

操作流程

2.1 樣本制備

將500 μL細(xì)胞懸液與20 μg質(zhì)粒DNA混合于預(yù)冷電轉(zhuǎn)杯，使用微量移液器（某品牌）確保液面覆蓋電極區(qū)域。超凈臺(tái)內(nèi)完成全部操作，環(huán)境溫度維持在4℃。

2.2 脈沖施加

選擇"哺乳動(dòng)物細(xì)胞"預(yù)設(shè)模式，單次脈沖持續(xù)時(shí)間自動(dòng)優(yōu)化至8-12 ms。電弧監(jiān)測(cè)系統(tǒng)實(shí)時(shí)顯示阻抗變化曲線，當(dāng)檢測(cè)到異常放電時(shí)自動(dòng)終止脈沖并報(bào)警。

2.3 后處理

脈沖結(jié)束后立即加入預(yù)溫培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移至37℃培養(yǎng)箱。設(shè)置對(duì)照組采用傳統(tǒng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法（某試劑），比較24/48/72 h熒光表達(dá)強(qiáng)度。

結(jié)果與討論

經(jīng)三次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)，威尼德Mini Pulser 399在HEK293細(xì)胞系中實(shí)現(xiàn)（89.7±2.3）%轉(zhuǎn)染效率，顯著高于對(duì)照組脂質(zhì)體法的（65.1±4.8）%（p<0.01）。活細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示實(shí)驗(yàn)組存活率為（86.4±3.1）%，與常規(guī)電穿孔設(shè)備相比提升15%。在植物原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染中，YFP信號(hào)檢出時(shí)間提前至6 h，較文獻(xiàn)報(bào)道縮短40%。

該設(shè)備的技術(shù)突破體現(xiàn)在三個(gè)維度：其一，模塊化電轉(zhuǎn)杯設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)原核/真核體系無(wú)縫切換，大腸桿菌JM109的電轉(zhuǎn)效率達(dá)到（3.2±0.4）×10^8 CFU/μg，滿足CRISPR文庫(kù)構(gòu)建需求；其二，電弧監(jiān)測(cè)系統(tǒng)將樣本損耗率控制在5%以?xún)?nèi)，相較傳統(tǒng)設(shè)備降低60%重復(fù)實(shí)驗(yàn)成本；其三，緊湊型結(jié)構(gòu)適配超凈臺(tái)操作，避免樣本轉(zhuǎn)移污染風(fēng)險(xiǎn)。

在疫苗研發(fā)場(chǎng)景中，設(shè)備成功實(shí)現(xiàn)VSV-G偽型慢病毒載體導(dǎo)入Vero細(xì)胞，TCID50測(cè)定顯示病毒滴度提升2個(gè)數(shù)量級(jí)。微生物工程應(yīng)用顯示，畢赤酵母GS115的電轉(zhuǎn)效率突破（1×10^5 transformants/μg DNA），為工業(yè)菌株改造提供新方案。

研究的創(chuàng)新性在于建立標(biāo)準(zhǔn)化電轉(zhuǎn)操作流程：采用預(yù)冷電轉(zhuǎn)杯可將脈沖熱效應(yīng)降低30%；樣本密度梯度實(shí)驗(yàn)證明1.2×10^7 cells/mL為最佳負(fù)載量；脈沖后靜置2 min策略使膜修復(fù)效率提升22%。這些發(fā)現(xiàn)為《分子生物學(xué)技術(shù)規(guī)范》修訂提供實(shí)證數(shù)據(jù)。

結(jié)論

威尼德Mini Pulser 399電穿孔系統(tǒng)通過(guò)技術(shù)創(chuàng)新解決傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染技術(shù)的三大痛點(diǎn)：預(yù)設(shè)程序降低操作門(mén)檻，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)保障實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性，模塊化設(shè)計(jì)擴(kuò)展應(yīng)用邊界。在基因治療載體生產(chǎn)、轉(zhuǎn)基因作物開(kāi)發(fā)等場(chǎng)景中，其30%的時(shí)間成本縮減與50%的維護(hù)成本優(yōu)勢(shì)，使之成為中小型研究機(jī)構(gòu)技術(shù)升級(jí)的理想選擇。

參考文獻(xiàn)

1. HFRSV核蛋白pEF-BOS真核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)[J].張婷婷;朱勇;金伯泉;張建平;孫凱,細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志.1998,第2期

2. 狂犬病病毒糖蛋白真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在COS-7細(xì)胞中的表達(dá)[J].姚為民;舒適;周華;隋紅;劉原舒;王志武,中國(guó)生物制品學(xué)雜志.2007,第9期

3. 重組質(zhì)粒電穿孔轉(zhuǎn)染條件探討[J].周智;張定鳳;任紅,重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào).1999,第2期

4. 陽(yáng)離子脂質(zhì)體與基因轉(zhuǎn)移[J].袁仕善;周智廣,生理科學(xué)進(jìn)展.1997,第2期

5. Sjcb2 DNA疫苗的構(gòu)建及其在HeLa細(xì)胞中的表達(dá)[J].胡永軒;肖建華;黃家芳;楊秋林,中國(guó)寄生蟲(chóng)學(xué)與寄生蟲(chóng)病雜志.2006,第5期

6. 馬冠狀病毒核衣殼蛋白基因片段的克隆及其表達(dá)[J].顧炳泉;彭志生;張敬友;張鶴曉;秦愛(ài)建;李建;高逢結(jié);仇鈺;金文杰;邵紅霞;孫謙,質(zhì)量安全與檢驗(yàn)檢測(cè).2007,第3期