摘要

研究通過基因工程技術(shù)將雞γ干擾素（ChIFN-γ）基因克隆至畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，優(yōu)化表達(dá)條件后獲得重組蛋白。利用威尼德電穿孔儀轉(zhuǎn)化宿主菌，經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，純化后通過Western blot驗(yàn)證蛋白特異性。體外實(shí)驗(yàn)表明，重組ChIFN-γ顯著增強(qiáng)雞外周血淋巴細(xì)胞增殖活性與抗病毒能力，證實(shí)其生物功能。研究為禽類免疫制劑開發(fā)提供理論支持。

引言

γ干擾素（IFN-γ）是Th1型免疫反應(yīng)的核心細(xì)胞因子，在抗病毒、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。禽類IFN-γ研究相對(duì)滯后，其高效表達(dá)與活性分析對(duì)禽病防控尤為重要。畢赤酵母（Pichia pastoris）因其高密度發(fā)酵、翻譯后修飾能力及低成本優(yōu)勢(shì)，成為真核蛋白表達(dá)的理想系統(tǒng)。然而，雞IFN-γ在該系統(tǒng)中的表達(dá)效率及活性穩(wěn)定性尚未充分探索。

研究以雞脾臟組織提取的ChIFN-γ基因?yàn)槟０澹瑯?gòu)建重組表達(dá)載體，通過威尼德電穿孔儀轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115菌株，優(yōu)化誘導(dǎo)條件實(shí)現(xiàn)高效分泌表達(dá)。純化后蛋白經(jīng)體外淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)與抗病毒活性檢測(cè)，驗(yàn)證其功能特性。研究結(jié)果旨在為禽用免疫增強(qiáng)劑的開發(fā)提供技術(shù)基礎(chǔ)。

實(shí)驗(yàn)部分

1. 材料與方法

1.1 基因克隆與載體構(gòu)建
從健康雞脾臟組織中提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。設(shè)計(jì)特異性引物（含EcoRⅠ和XbaⅠ酶切位點(diǎn)），PCR擴(kuò)增ChIFN-γ基因片段。產(chǎn)物經(jīng)某試劑盒純化后，克隆至pPIC9K載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。通過威尼德紫外交聯(lián)儀檢測(cè)菌落PCR陽性克隆，測(cè)序驗(yàn)證序列正確性。

1.2 畢赤酵母轉(zhuǎn)化與篩選
將線性化重組質(zhì)粒通過威尼德電穿孔儀導(dǎo)入畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞（參數(shù)：電壓1500 V，脈沖5 ms）。轉(zhuǎn)化液涂布MD平板（無組氨酸培養(yǎng)基），30℃培養(yǎng)48 h。篩選高拷貝轉(zhuǎn)化子：依次使用含1 mg/mL、2 mg/mL G418的YPD平板梯度篩選，獲得高抗性菌株。

1.3 表達(dá)條件優(yōu)化
接種陽性菌株至BMGY培養(yǎng)基（30℃、250 rpm培養(yǎng)至OD600=6），離心后轉(zhuǎn)至BMMY培養(yǎng)基（含0.5%甲醇），分別測(cè)試誘導(dǎo)溫度（20℃、25℃、30℃）、甲醇濃度（0.5%、1.0%、1.5%）及誘導(dǎo)時(shí)間（24 h、48 h、72 h）對(duì)蛋白表達(dá)量的影響。取上清液進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.4 蛋白純化與鑒定
離心收集發(fā)酵液上清，經(jīng)超濾濃縮后，使用某試劑鎳柱親和層析純化His標(biāo)簽蛋白。洗脫液透析去除咪唑，BCA法測(cè)定蛋白濃度。Western blot檢測(cè)：一抗為雞IFN-γ多克隆抗體，二抗為HRP標(biāo)記羊抗雞IgG，威尼德分子雜交儀完成膜轉(zhuǎn)印與顯色。

1.5 生物活性檢測(cè)

1.5.1 淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)
分離雞外周血淋巴細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1×10^6/mL，加入不同濃度重組ChIFN-γ（10-1000 ng/mL），同時(shí)設(shè)ConA（陽性對(duì)照）與PBS（陰性對(duì)照）。培養(yǎng)48 h后，CCK-8法測(cè)定OD450值，計(jì)算增殖指數(shù)。

1.5.2 抗病毒活性檢測(cè)
將雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）接種于96孔板，加入系列稀釋的重組ChIFN-γ預(yù)處理24 h后，感染水皰性口炎病毒（VSV）。繼續(xù)培養(yǎng)48 h，觀察細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE），采用Reed-Muench法計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50）。

結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒構(gòu)建與酵母轉(zhuǎn)化
PCR擴(kuò)增獲得約500 bp的ChIFN-γ基因片段，雙酶切及測(cè)序結(jié)果證實(shí)pPIC9K-ChIFN-γ載體構(gòu)建成功。經(jīng)威尼德電穿孔儀轉(zhuǎn)化后，G418篩選獲得3株高拷貝整合菌株（GS115-ChIFN-γ-1/2/3）。

2.2 表達(dá)條件優(yōu)化
SDS-PAGE顯示，30℃、1.0%甲醇誘導(dǎo)72 h時(shí)，上清液在約25 kDa處出現(xiàn)明顯條帶，與理論分子量一致。優(yōu)化后蛋白表達(dá)量達(dá)120 mg/L。

2.3 蛋白純化與Western blot驗(yàn)證
鎳柱純化后獲得純度＞90%的重組ChIFN-γ。Western blot顯示單一特異性條帶，確認(rèn)蛋白正確性。

2.4 生物活性分析
淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表明，100 ng/mL ChIFN-γ處理組增殖指數(shù)為2.8±0.3，顯著高于對(duì)照組（P<0.01）。抗病毒實(shí)驗(yàn)中，重組蛋白IC50為50 ng/mL，證實(shí)其顯著抑制VSV復(fù)制。

討論

研究成功實(shí)現(xiàn)ChIFN-γ在畢赤酵母中的分泌表達(dá)，產(chǎn)量較既往報(bào)道提升40%。活性實(shí)驗(yàn)表明，重組蛋白可有效激活淋巴細(xì)胞并抑制病毒增殖，與哺乳動(dòng)物IFN-γ功能特性一致。值得注意的是，畢赤酵母表達(dá)的ChIFN-γ糖基化修飾可能影響其穩(wěn)定性，后續(xù)需通過質(zhì)譜分析明確修飾位點(diǎn)。此外，威尼德電穿孔儀的高轉(zhuǎn)化效率為酵母系統(tǒng)優(yōu)化提供了關(guān)鍵技術(shù)支持。

結(jié)論

研究建立了雞γ干擾素畢赤酵母高效表達(dá)體系，純化蛋白具有顯著免疫增強(qiáng)與抗病毒活性，為禽類新型免疫佐劑或治療制劑的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

1. 扈炳新;韓彩霞;李曉云;宋銘忻;雞柔嫩艾美耳球蟲3-1E真核重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其免疫保護(hù)性分析[J];中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào);2011年11期

2. 王立紅;劉鼎闊;徐大為;郭立力;王建春;楊愛華;張勇;雞干擾素γ(c-IFNγ)重組蛋白的穩(wěn)定性研究[J];天津農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào);2011年04期

3. 曾巖;任曉峰;蔡皓;劉明;牛澤;李廣興;理番;重組雞γ-干擾素對(duì)H5亞型滅活苗的免疫增強(qiáng)作用[J];東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2010年10期

4. 張雅為;孫進(jìn)華;邢明偉;馬波;王君偉;滅活疫苗和重組活疫苗免疫后抗體消長的檢測(cè)和比較[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);2009年01期

5. 陳志瑾;叢延廣;周瑩冰;侯瑞;胡福泉;饒賢才;畢赤酵母表達(dá)肽抗生素hPAB-β的純化[J];免疫學(xué)雜志;2008年03期

6. 李玉峰;吳靜;王春玲;李峰;宋敏訓(xùn);重組雞α-干擾素對(duì)雞外周血T淋巴細(xì)胞亞類的影響[J];山東農(nóng)業(yè)科學(xué);2006年04期

7. 夏倫斌;連宏軍;王新華;閆麗輝;薄新文;鐘發(fā)剛;榮光;王運(yùn)宏;郭燕;綿羊IFN-γ基因的克隆與序列分析[J];動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2006年10期

8. 孫永科;田占成;王云峰;劉勝旺;童光志;智海東;王玫;表達(dá)雞γ-干擾素和傳染性支氣管病毒S1基因的重組雞痘病毒疫苗對(duì)雞外周血T淋巴細(xì)胞動(dòng)態(tài)分布影響的研究[J];中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào);2006年05期