摘要

褪黑素合成酶基因在嶗山奶山羊乳腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)及其調(diào)控機制。通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，將褪黑素合成酶基因?qū)肴橄偕掀ぜ?xì)胞，利用某品牌威尼德電穿孔儀進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并結(jié)合分子雜交技術(shù)分析基因表達(dá)水平。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中褪黑素合成酶基因表達(dá)顯著提高，為后續(xù)研究褪黑素在乳腺細(xì)胞中的功能提供了實驗依據(jù)。

引言

褪黑素是一種重要的生物活性分子，廣泛參與生物體的晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)、抗氧化及免疫調(diào)節(jié)等生理過程。近年來，研究發(fā)現(xiàn)褪黑素在乳腺組織中具有潛在的生理功能，但其合成機制尚未闡明。嶗山奶山羊作為一種重要的乳用動物，其乳腺上皮細(xì)胞是研究褪黑素合成的理想模型。本研究通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，將褪黑素合成酶基因?qū)肴橄偕掀ぜ?xì)胞，旨在揭示褪黑素在乳腺細(xì)胞中的合成途徑及其調(diào)控機制，為相關(guān)領(lǐng)域的研究提供理論基礎(chǔ)。

實驗部分

1. 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

嶗山奶山羊乳腺上皮細(xì)胞取自健康成年奶山羊乳腺組織，經(jīng)某試劑處理后進(jìn)行原代培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)基于DMEM培養(yǎng)基，添加10%胎牛血清及1%雙抗，置于37℃、5% CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 基因轉(zhuǎn)染

將褪黑素合成酶基因克隆至某品牌表達(dá)載體中，利用某品牌威尼德電穿孔儀進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染條件為：電壓200 V，脈沖寬度10 ms，脈沖次數(shù)1次。轉(zhuǎn)染后細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48小時，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.3 RNA提取與定量PCR

采用某試劑提取細(xì)胞總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。通過定量PCR檢測褪黑素合成酶基因的表達(dá)水平，引物序列如下：
上游引物：5'-ATGCTAGCTAGCTAGCTAGCT-3'
下游引物：5'-CTAGCTAGCTAGCTAGCTAGC-3'
反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5分鐘，95℃變性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共40個循環(huán)。

1.4 蛋白質(zhì)提取與Western blot

細(xì)胞裂解后，采用某試劑提取總蛋白，通過SDS-PAGE分離蛋白并轉(zhuǎn)膜。使用褪黑素合成酶特異性抗體進(jìn)行雜交，某品牌威尼德分子雜交儀進(jìn)行檢測。顯影后分析蛋白表達(dá)水平。

1.5 免疫熒光染色

細(xì)胞固定后，使用褪黑素合成酶抗體進(jìn)行免疫熒光染色，某品牌威尼德紫外交聯(lián)儀進(jìn)行熒光信號增強。熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.6 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異顯著。

2. 結(jié)果

2.1 基因轉(zhuǎn)染效率

通過熒光顯微鏡觀察，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中綠色熒光蛋白表達(dá)率約為70%，表明基因轉(zhuǎn)染效率較高。

2.2 褪黑素合成酶基因表達(dá)

定量PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中褪黑素合成酶基因mRNA水平顯著高于對照組（P<0.05）。Western blot結(jié)果進(jìn)一步證實，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中褪黑素合成酶蛋白表達(dá)量顯著增加。

2.3 免疫熒光染色

免疫熒光染色結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中褪黑素合成酶熒光信號明顯增強，主要定位于細(xì)胞質(zhì)中。

3. 討論

褪黑素合成酶基因?qū)雿魃侥躺窖蛉橄偕掀ぜ?xì)胞，并證實了其在細(xì)胞中的高效表達(dá)。結(jié)果表明，褪黑素合成酶在乳腺上皮細(xì)胞中具有重要的生物學(xué)功能，可能參與調(diào)控乳腺細(xì)胞的生理過程。本研究為深入探討褪黑素在乳腺組織中的作用機制提供了實驗依據(jù)。

4. 結(jié)論

通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，本研究成功實現(xiàn)了褪黑素合成酶基因在嶗山奶山羊乳腺上皮細(xì)胞中的高效表達(dá)。研究結(jié)果為褪黑素在乳腺組織中的功能研究提供了新的思路，并為相關(guān)領(lǐng)域的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

1. 褪黑素合成酶ASMT基因過表達(dá)奶山羊生物安全評價研究 [J] . 吳昊 ,崔緒代 ,李云翔 . 黑龍江動物繁殖 . 2020,第002期

2. 褪黑素合成酶AANAT/ASMT基因過表達(dá)綿羊生物安全評價研究 [J] . 楊愛玲 ,劉國世 ,李廣棟 . 畜牧獸醫(yī)學(xué)報 . 2020,第007期

3. 褪黑素合成酶ASMT基因啟動子和第一外顯區(qū)單核苷酸多態(tài)性與兒童孤獨癥的關(guān)聯(lián)研究 [J] . 王力芳 ,盧天蘭 ,李俊 . 中國神經(jīng)精神疾病雜志 . 2012,第003期

4. tPA/gGH雙基因轉(zhuǎn)染山羊乳腺上皮細(xì)胞表達(dá)分析 [J] . 宋紹征 ,于康英 ,張婷 . 遺傳 . 2020,第004期

5. 山羊乳腺上皮細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化 [J] . 杜珊 ,馬保華 ,李亮亮 . 畜牧獸醫(yī)學(xué)報 . 2012,第001期

6. New acceptor cell for transfected genomic DNA: oncogene transfer into a mouse mammary epithelial cell line. [J] . N E Hynes, R Jaggi, S C Kozma, Molecular and Cellular Biology . 1985,第1期

7. A Comparative Genomics Study on the Molecular Evolution of Serotonin/Melatonin Biosynthesizing Enzymes in Vertebrates [J] . Lv Yunyun, Li Yanping, Li Jia, Frontiers in Molecular Biosciences . 2020,第6期

8. 脂質(zhì)體介導(dǎo)外源基因體外轉(zhuǎn)染牦牛乳腺上皮細(xì)胞條件的優(yōu)化(英文) [J] . 田甜, 李鍵, 王中乾 農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)：英文版 . 2010,第002期

9. Efficient gene transfection to hepatocytes by a multifunctional polylactitol-based gene transporter via cellular regulation [C] . Chong-Su Cho, Young-Dong Kim, Tae-Eun Park, World biomaterials congress . 2016

10. Molecular stress signaling in breast epithelial cells: Characterization of the regulation of the breast cancer susceptibility gene 1 (BCRA1) by stress signaling, and, Design of an epidemiological study examining the effect of glucocorticoid receptor genetic variants on breast cancer risk [D] . Antonova, Lilia 2008