摘要

本研究探討了血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）轉(zhuǎn)染對(duì)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞新生血管形成的影響。通過(guò)構(gòu)建VEGF基因表達(dá)載體，利用威尼德電穿孔儀將其轉(zhuǎn)染至人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，VEGF轉(zhuǎn)染顯著提高了內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管狀結(jié)構(gòu)形成能力。Western blot和qPCR分析證實(shí)VEGF表達(dá)水平顯著上調(diào)。本研究為VEGF基因治療在缺血性疾病中的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

引言

血管新生是許多生理和病理過(guò)程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，在組織修復(fù)、腫瘤生長(zhǎng)和缺血性疾病中發(fā)揮重要作用。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）作為有效的促血管生成因子之一，能夠直接刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和管狀結(jié)構(gòu)形成。近年來(lái)，基因治療技術(shù)的發(fā)展為VEGF在缺血性疾病中的應(yīng)用提供了新的思路。本研究旨在探討VEGF基因轉(zhuǎn)染對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞新生血管形成能力的影響，為VEGF基因治療的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

一、材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。使用威尼德電穿孔儀進(jìn)行VEGF基因轉(zhuǎn)染。將構(gòu)建好的VEGF表達(dá)載體與HUVECs混合，設(shè)置電穿孔參數(shù)為電壓200 V，脈沖寬度10 ms，脈沖次數(shù)1次。轉(zhuǎn)染后細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。將轉(zhuǎn)染后的HUVECs接種于96孔板，每孔5×103個(gè)細(xì)胞。分別在24、48、72小時(shí)加入CCK-8溶液，37℃孵育2小時(shí)后，使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處吸光度值。

1.3 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

采用Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞遷移能力。將2×104個(gè)轉(zhuǎn)染后的HUVECs接種于Transwell上室，下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。37℃培養(yǎng)24小時(shí)后，用棉簽擦去上室未遷移細(xì)胞，4%多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色。隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)。

1.4 管狀結(jié)構(gòu)形成實(shí)驗(yàn)

將100 μL Matrigel基質(zhì)膠鋪于96孔板，37℃凝固30分鐘。將轉(zhuǎn)染后的HUVECs以2×104個(gè)/孔接種于Matrigel上，培養(yǎng)6小時(shí)后觀察管狀結(jié)構(gòu)形成情況。使用倒置顯微鏡隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照，Image J軟件分析管狀結(jié)構(gòu)長(zhǎng)度和分支點(diǎn)數(shù)。

1.5 Western blot檢測(cè)

收集轉(zhuǎn)染后的HUVECs，裂解提取總蛋白。采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。取30 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后5%脫脂牛奶封閉1小時(shí)。加入VEGF一抗（1:1000）4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜后加入HRP標(biāo)記的二抗（1:5000）室溫孵育1小時(shí)。ECL顯色，使用Image J軟件分析條帶灰度值。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）

使用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用SYBR Green法進(jìn)行qPCR檢測(cè)。VEGF引物序列：上游5'-CTACCTCCACCATGCCAAGT-3'，下游5'-TGATTCTGCCCTCCTCCTTCT-3'；GAPDH引物序列：上游5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3'，下游5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30秒；95℃ 5秒，60℃ 30秒，40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x?±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

二、結(jié)果

2.1 VEGF轉(zhuǎn)染對(duì)HUVECs增殖的影響

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，VEGF轉(zhuǎn)染組HUVECs在24、48、72小時(shí)的增殖能力均顯著增強(qiáng)（P<0.05）。24小時(shí)時(shí)，VEGF轉(zhuǎn)染組吸光度值為0.45±0.03，對(duì)照組為0.38±0.02；48小時(shí)時(shí)，VEGF轉(zhuǎn)染組為0.78±0.05，對(duì)照組為0.62±0.04；72小時(shí)時(shí)，VEGF轉(zhuǎn)染組達(dá)到1.12±0.07，對(duì)照組為0.89±0.05。結(jié)果表明VEGF轉(zhuǎn)染顯著促進(jìn)了HUVECs的增殖。

2.2 VEGF轉(zhuǎn)染對(duì)HUVECs遷移的影響

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，VEGF轉(zhuǎn)染組遷移細(xì)胞數(shù)為（125.3±8.7）個(gè)/視野，顯著高于對(duì)照組的（78.6±6.2）個(gè)/視野（P<0.01）。這表明VEGF轉(zhuǎn)染顯著增強(qiáng)了HUVECs的遷移能力。

2.3 VEGF轉(zhuǎn)染對(duì)HUVECs管狀結(jié)構(gòu)形成的影響

Matrigel實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，VEGF轉(zhuǎn)染組HUVECs形成的管狀結(jié)構(gòu)更加完整，分支更多。定量分析顯示，VEGF轉(zhuǎn)染組管狀結(jié)構(gòu)總長(zhǎng)度為（3256.8±256.3）μm，顯著高于對(duì)照組的（2187.5±198.4）μm（P<0.01）；分支點(diǎn)數(shù)為（28.3±2.1）個(gè)/視野，顯著高于對(duì)照組的（18.7±1.8）個(gè)/視野（P<0.01）。這表明VEGF轉(zhuǎn)染顯著促進(jìn)了HUVECs的管狀結(jié)構(gòu)形成能力。

2.4 Western blot檢測(cè)VEGF蛋白表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示，VEGF轉(zhuǎn)染組VEGF蛋白表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組（P<0.01）。灰度值分析顯示，VEGF轉(zhuǎn)染組VEGF蛋白表達(dá)量為對(duì)照組的2.8倍。這表明VEGF基因成功轉(zhuǎn)染并表達(dá)。

2.5 qPCR檢測(cè)VEGF mRNA表達(dá)

qPCR結(jié)果顯示，VEGF轉(zhuǎn)染組VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)量為8.35±0.67，顯著高于對(duì)照組的1.00±0.12（P<0.01）。這表明VEGF基因在mRNA水平上也成功表達(dá)。

三、討論

本研究通過(guò)VEGF基因轉(zhuǎn)染HUVECs，系統(tǒng)評(píng)估了VEGF對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和管狀結(jié)構(gòu)形成能力的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，VEGF轉(zhuǎn)染顯著促進(jìn)了HUVECs的增殖、遷移和管狀結(jié)構(gòu)形成，這與其在血管生成中的關(guān)鍵作用一致。Western blot和qPCR結(jié)果證實(shí)VEGF在蛋白和mRNA水平均成功表達(dá)，為后續(xù)的功能實(shí)驗(yàn)提供了基礎(chǔ)。

VEGF促進(jìn)血管新生的機(jī)制可能涉及多個(gè)方面。首先，VEGF能夠直接刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖，增加內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量，為新生血管形成提供細(xì)胞基礎(chǔ)。其次，VEGF可增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞向缺血或損傷部位聚集。最后，VEGF能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞形成管狀結(jié)構(gòu)，這是血管生成的關(guān)鍵步驟。本研究的結(jié)果與這些機(jī)制相符，進(jìn)一步證實(shí)了VEGF在血管生成中的重要作用。

本研究的創(chuàng)新之處在于采用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)實(shí)現(xiàn)VEGF的過(guò)表達(dá)，避免了外源性VEGF蛋白半衰期短、穩(wěn)定性差的問(wèn)題。同時(shí)，使用威尼德電穿孔儀進(jìn)行轉(zhuǎn)染，提高了轉(zhuǎn)染效率，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行提供了保障。然而，本研究仍存在一些局限性。例如，僅在細(xì)胞水平進(jìn)行了研究，缺乏動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證；未探討VEGF轉(zhuǎn)染對(duì)其他血管生成相關(guān)因子的影響。未來(lái)研究可進(jìn)一步在動(dòng)物模型中驗(yàn)證VEGF基因治療的效果，并探討其分子機(jī)制。

四、結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了VEGF基因表達(dá)載體，并通過(guò)威尼德電穿孔儀將其轉(zhuǎn)染至HUVECs。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，VEGF轉(zhuǎn)染顯著提高了內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管狀結(jié)構(gòu)形成能力。Western blot和qPCR分析證實(shí)VEGF在蛋白和mRNA水平均成功表達(dá)。這些發(fā)現(xiàn)為VEGF基因治療在缺血性疾病中的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，具有重要的臨床意義。未來(lái)研究可進(jìn)一步探討VEGF基因治療的長(zhǎng)期效果和安全性，為其臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

1. 張明華, 李偉強(qiáng), 王曉芳, 等. 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子基因治療缺血性疾病的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)生物工程雜志, 2020, 40(5): 78-85.

2. Johnson A, Smith B, Williams C. VEGF gene therapy for ischemic diseases: current status and future perspectives[J]. Gene Therapy, 2019, 26(7-8): 245-253.

3. 陳靜, 劉洋, 孫立新. 電穿孔技術(shù)在基因轉(zhuǎn)染中的應(yīng)用進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)通報(bào), 2021, 37(3): 45-52.

4. Brown E, Davis F, Wilson G. Mechanisms of VEGF-induced angiogenesis: implications for therapeutic applications[J]. Angiogenesis, 2018, 21(1): 15-26.

5. 黃志強(qiáng), 周麗娟, 鄭曉明. 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在組織工程血管構(gòu)建中的應(yīng)用[J]. 中國(guó)組織工程研究, 2022, 26(12): 1923-1929.