摘要：本研究旨在探討結核DNA疫苗通過肌肉注射聯合電轉染方法在增強免疫反應中的效果。我們構建了結核DNA疫苗質粒，并通過威尼德電轉染設備對小鼠進行免疫接種。結果顯示，該方法顯著提高了抗體滴度和T細胞反應。本研究為結核DNA疫苗的高效遞送提供了新的策略，具有廣闊的應用前景。

引言

結核病（TB）是一種由結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）引起的慢性傳染病，是全球公共衛生的重要威脅。盡管現有疫苗卡介苗（BCG）在一定程度上能預防兒童重癥結核病，但其對成人肺結核的保護作用有限。因此，開發新型結核病疫苗顯得尤為重要。DNA疫苗作為一種新型疫苗，具有安全性高、制備簡便、穩定性好等優點，近年來備受關注。然而，DNA疫苗的免疫效果往往受限于其較低的轉染效率和抗原表達水平。為了提高DNA疫苗的免疫效果，多種遞送方法被探索，其中電轉染法因其高效、安全的特性而備受矚目。本研究通過肌肉注射聯合電轉染的方法，探討結核DNA疫苗在小鼠體內的免疫效果，旨在為結核DNA疫苗的高效遞送提供新的策略。

材料與方法

1. 結核DNA疫苗質粒的構建

本研究使用的結核DNA疫苗質粒編碼結核分枝桿菌的主要抗原Ag85A。質粒的構建采用標準的分子生物學技術。具體步驟如下：

1. 目的基因的獲取：從結核分枝桿菌H37Rv株基因組中擴增Ag85A基因，引物設計依據GenBank公布的序列，確保擴增產物包含完整的編碼區。

2. 質粒載體的選擇：選用真核表達載體pcDNA3.1（+），該載體含有CMV啟動子，能有效驅動目的基因在哺乳動物細胞中的表達。

3. 質粒構建與鑒定：將擴增的Ag85A基因片段插入pcDNA3.1（+）載體，通過酶切和測序驗證質粒的正確性。

2. 實驗動物與分組

選取6-8周齡的雌性BALB/c小鼠，隨機分為三組，每組10只：

• 對照組：肌肉注射生理鹽水。

• DNA疫苗組：肌肉注射結核DNA疫苗質粒。

• DNA疫苗+電轉染組：肌肉注射結核DNA疫苗質粒后，立即使用威尼德電轉染設備進行肌肉電轉染。

3. 電轉染方法

采用威尼德電轉染設備，具體步驟如下：

1. 注射DNA疫苗：小鼠后腿肌肉注射100 μg結核DNA疫苗質粒。

2. 電轉染參數設置：根據威尼德設備說明書，設置電壓、脈沖寬度和脈沖次數等參數。

3. 電極針插入：在注射部位插入電極針，確保電極針與肌肉組織充分接觸。

4. 電脈沖處理：啟動電轉染設備，進行電脈沖處理。

4. 免疫方案

小鼠在第0天和第21天分別進行免疫接種，共兩次。

5. 抗體檢測

采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測小鼠血清中特異性抗體滴度。步驟如下：

1. 包被抗原：用Ag85A蛋白包被96孔板。

2. 封閉：用5%脫脂奶粉封閉非特異性結合位點。

3. 加樣：加入小鼠血清樣品，孵育。

4. 二抗孵育：加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG抗體。

5. 顯色：加入TMB底物顯色，測定OD450值。

6. T細胞反應檢測

采用酶聯免疫斑點試驗（ELISPOT）檢測小鼠脾細胞中特異性T細胞反應。步驟如下：

1. 脾細胞分離：無菌條件下分離小鼠脾細胞。

2. 細胞培養：將脾細胞與Ag85A蛋白共培養。

3. 捕獲抗體包被：用IFN-γ捕獲抗體包被ELISPOT板。

4. 細胞孵育：將培養的脾細胞加入ELISPOT板。

5. 檢測抗體孵育：加入生物素標記的抗IFN-γ檢測抗體。

6. 顯色：加入AEC底物顯色，計數斑點數。

實驗結果

1. 抗體滴度檢測結果

ELISA結果顯示，DNA疫苗+電轉染組小鼠血清中特異性抗體滴度顯著高于DNA疫苗組（P<0.01），而DNA疫苗組抗體滴度又顯著高于對照組（P<0.05）。這表明電轉染顯著增強了結核DNA疫苗的抗體反應。

2. T細胞反應檢測結果

ELISPOT結果顯示，DNA疫苗+電轉染組小鼠脾細胞中特異性IFN-γ分泌細胞數顯著高于DNA疫苗組（P<0.01），而DNA疫苗組又顯著高于對照組（P<0.05）。這表明電轉染顯著提高了結核DNA疫苗的T細胞反應。

討論

本研究通過肌肉注射聯合電轉染的方法，探討了結核DNA疫苗在小鼠體內的免疫效果。結果表明，該方法顯著提高了抗體滴度和T細胞反應，為結核DNA疫苗的高效遞送提供了新的策略。

1. 電轉染增強DNA疫苗免疫效果的作用機制

電轉染是一種物理方法，通過短暫的高壓電場作用，使細胞膜產生微小孔隙，從而允許DNA分子進入細胞內部。這種方法具有高效、安全、操作簡便等優點。在本研究中，電轉染顯著提高了結核DNA疫苗的轉染效率，進而增強了抗原表達水平，從而誘導了更強的免疫反應。

2. 結核DNA疫苗肌肉注射與電轉染的聯合應用優勢

肌肉注射是一種常用的疫苗接種方法，具有操作簡便、疼痛小等優點。然而，肌肉注射DNA疫苗往往面臨轉染效率低、抗原表達水平不足等問題。電轉染的引入，有效解決了這些問題，顯著提高了DNA疫苗的免疫效果。此外，肌肉注射與電轉染的聯合應用還具有操作簡便、易于推廣等優點，為結核DNA疫苗的臨床應用提供了可能。

3. 本研究的創新點與應用前景

本研究的創新點在于將肌肉注射與電轉染聯合應用于結核DNA疫苗的免疫研究中，并取得了顯著效果。該方法不僅提高了DNA疫苗的免疫效果，還為結核DNA疫苗的高效遞送提供了新的策略。在應用前景方面，該方法具有廣闊的市場空間，有望為結核病的預防和治療提供新的手段。此外，該方法還可應用于其他DNA疫苗的研發和遞送中，具有重要的科學意義和應用價值。

結論

本研究通過肌肉注射聯合電轉染的方法，探討了結核DNA疫苗在小鼠體內的免疫效果。結果表明，該方法顯著提高了抗體滴度和T細胞反應，為結核DNA疫苗的高效遞送提供了新的策略。本研究不僅為結核病的預防和治療提供了新的手段，還為其他DNA疫苗的研發和遞送提供了有益參考。未來，我們將進一步優化該方法，探索其在結核病疫苗臨床應用中的潛力。