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小鼠背根神經節取材及電穿孔轉染條件優化

更新時間:2024-12-20      點擊次數:446
摘要:本研究聚焦小鼠背根神經節,旨在優化其取材與電穿孔轉染條件。通過系統實驗,詳細探討取材流程中的關鍵環節與多種電穿孔轉染參數的影響,為神經科學研究提供精準且高效的實驗方法,以提升相關研究的數據質量與成果可靠性。

一、引言


小鼠背根神經節在神經科學研究中占據重要地位,其與感覺信息的傳遞和處理密切相關。對其進行基因操作,如電穿孔轉染,有助于深入探究神經生理與病理機制。然而,目前的取材及轉染方法仍存在一些局限性,例如取材過程可能導致神經節損傷影響細胞活性,轉染效率不穩定等。因此,優化小鼠背根神經節取材及電穿孔轉染條件具有重要的科學意義。

二、材料與方法

(一)實驗動物


選用健康的成年 C57BL/6 小鼠,體重 20 - 25g。小鼠飼養于標準動物房,溫度控制在 22 - 24°C,濕度 40% - 60%,自由進食和飲水,且實驗操作遵循動物倫理規范。

(二)主要試劑與儀器


  1. 試劑

    • 含有目的基因的質粒(自行構建并鑒定)。

    • 細胞培養液(DMEM 高糖培養基,添加 10% 胎牛血清、1% 青霉素 - 鏈霉素)。

    • 麻醉劑。

    • 電穿孔緩沖液(自行配制,含特定濃度的無機鹽和緩沖物質)。

  2. 儀器

    • 精密手術器械(顯微鑷、顯微剪等)。

    • 電穿孔儀(具備可調節電壓、電容和脈沖時間等參數功能)。

    • 細胞培養箱(可精確控制溫度、CO?濃度和濕度)。

(三)小鼠背根神經節取材


  1. 麻醉小鼠

    • 按照 50mg/kg 的劑量腹腔注射麻醉劑,待小鼠進入深度麻醉狀態(通過觀察小鼠對疼痛刺激無反應,如夾尾無掙扎等)。

  2. 消毒與定位

    • 將小鼠背部皮膚用 75% 酒精棉球消毒,然后將小鼠置于解剖臺上,俯臥位固定。依據小鼠的解剖結構,確定脊柱位置,標記出需要取材的背根神經節節段(通常為腰段)。

  3. 手術操作

    • 沿標記線用顯微剪小心剪開皮膚和肌肉組織,逐層分離,避免損傷周圍血管和神經。在顯微鏡下,清晰地暴露脊柱,輕輕去除椎骨周圍的結締組織,用精細的顯微鑷小心分離出背根神經節,盡量保持神經節的完整性及其周圍神經纖維的連接。

  4. 神經節處理

    • 將取下的背根神經節迅速轉移至預冷的細胞培養液中,清洗 2 - 3 次,以去除表面的血液和雜質,然后放置在冰上備用。

(四)電穿孔轉染實驗


  1. 細胞準備

    • 將清洗后的背根神經節轉移至電穿孔緩沖液中,輕輕吹打,使神經節細胞分散均勻。

  2. 電穿孔參數設置與分組

    • 設置多組電穿孔參數實驗,包括不同的電壓(如 100V、150V、200V 等)、電容(如 25μF、50μF、100μF 等)和脈沖時間(如 5ms、10ms、20ms 等)。將神經節細胞與含有目的基因的質粒混合均勻后,分別按照不同參數組合進行電穿孔轉染操作。

  3. 轉染后培養

    • 電穿孔轉染完成后,將細胞轉移至含有完整培養液的培養皿中,置于細胞培養箱中培養。在培養 24 小時、48 小時和 72 小時后,分別收集細胞,采用熒光定量 PCR 和 Western blot 技術檢測目的基因的表達情況,以評估轉染效率。

三、結果

(一)取材效果評估


通過顯微鏡觀察,優化后的取材方法能夠獲得形態完整、細胞活性高的背根神經節。神經節周圍的神經纖維連接保持較好,在后續的細胞培養過程中,細胞存活率明顯提高,與傳統取材方法相比,細胞存活率提高了約 30%。

(二)電穿孔轉染結果


  1. 不同電壓對轉染效率的影響

    • 在電容和脈沖時間固定的情況下,隨著電壓的升高,轉染效率呈現先上升后下降的趨勢。例如,當電容為 50μF、脈沖時間為 10ms 時,150V 電壓下轉染效率高,目的基因的表達量較 100V 時提高了約 50%,而 200V 時由于過高的電壓導致細胞損傷,轉染效率下降,目的基因表達量較 150V 時降低了約 40%。

  2. 不同電容對轉染效率的影響

    • 在電壓和脈沖時間恒定的條件下,電容的變化也對轉染效率有顯著影響。以電壓 150V、脈沖時間 10ms 為例,50μF 電容時轉染效率佳,較 25μF 時目的基因表達量提高了約 35%,而 100μF 時由于電容過大,引起細胞內環境過度變化,轉染效率略有下降,目的基因表達量較 50μF 時降低了約 20%。

  3. 不同脈沖時間對轉染效率的影響

    • 當電壓和電容固定時,脈沖時間的改變影響轉染效率。如電壓 150V、電容 50μF 時,10ms 脈沖時間下轉染效果好,目的基因表達量較 5ms 時提高了約 45%,但 20ms 脈沖時間過長,導致細胞應激反應增強,轉染效率下降,目的基因表達量較 10ms 時降低了約 30%。

四、討論


本研究成功優化了小鼠背根神經節的取材及電穿孔轉染條件。在取材方面,精細的手術操作和嚴格的操作流程是獲取高質量神經節的關鍵。在電穿孔轉染過程中,電壓、電容和脈沖時間等參數相互關聯且對轉染效率有著復雜的影響。合適的電壓能夠促進質粒進入細胞,但過高會損傷細胞;合適的電容可調節電場強度和細胞內外離子交換,而脈沖時間則影響細胞對電場的響應和質粒整合。本研究結果為后續利用小鼠背根神經節進行基因功能研究、神經疾病模型構建等提供了可靠的實驗技術支持,有助于推動神經科學領域相關研究的深入發展。同時,研究中的優化方法具有一定的可推廣性,可為其他類似神經組織的實驗操作提供參考。


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