威尼德紫外交聯(lián)儀：EMSA實驗中常見問題總結(jié)

威尼德生物科技（北京）有限公司，使用UVA(365nm)、UVB(302 nm)、UVC(254 nm)三種波長制造了四款紫外交聯(lián)儀，主要包括VL-1000A系列紫外交聯(lián)儀（365nm）、VL-1000B系列紫外交聯(lián)儀（302nm）、VL-1000C系列紫外交聯(lián)儀（254nm）、VL-3000系列紫外交聯(lián)儀（三種波長）滿足不同的科研需求。

1、為什么看不到遷移帶？

1）蛋白樣本提取質(zhì)量不高，蛋白降解或者提取量不足。

2）樣本中沒有可以與探針結(jié)合的蛋白。

3）探針與蛋白無特異性的相互作用。

4）轉(zhuǎn)膜效率低，蛋白或者探針未轉(zhuǎn)移到膜上。

5）曝光或者成像時間過短。

在Super-Shift EMSA測定中看不到Super-Shift DNA/蛋白復(fù)合物帶還可能有以下原因：

6）抗體沒有工作。不是所有的抗體都可以用于Super-Shift EMSA，只有對非變性蛋白的表面抗原決定簇起反應(yīng)的抗體才能夠用于Super-Shift EMSA。

7）測定的活化的DNA/蛋白復(fù)合物中沒有希望檢測的構(gòu)成成分存在。此時既看不到Super-Shift的帶，也看不到DNA/蛋白復(fù)合物的量的減少

8）使用的抗體過度稀釋。一般10-20ul的反應(yīng)液需要使用0.5-1ul原倍的抗體。

9）多抗與DNA/蛋白復(fù)合物形成大的聚集物而不進(jìn)膠。在這種情況下，雖然看不到Super-Shift的帶，但應(yīng)當(dāng)可以看到DAN/蛋白復(fù)合物的電泳帶明顯減少。

威尼德生物科技（北京）有限公司，使用UVA(365nm)、UVB(302 nm)、UVC(254 nm)三種波長制造了四款紫外交聯(lián)儀，主要包括VL-1000A系列紫外交聯(lián)儀（365nm）、VL-1000B系列紫外交聯(lián)儀（302nm）、VL-1000C系列紫外交聯(lián)儀（254nm）、VL-3000系列紫外交聯(lián)儀（三種波長）滿足不同的科研需求。

2、為什么實驗背景高？

1）曝光或者成像時間過長。

2）封閉時間不足或者效率不高。

3）洗滌效果不佳。

4）實驗過程中膜沒有一直處于濕潤狀態(tài)。

3、EMSA測定需要多少量的蛋白與標(biāo)記的探針？

威尼德生物科技（北京）有限公司，使用UVA(365nm)、UVB(302 nm)、UVC(254 nm)三種波長制造了四款紫外交聯(lián)儀，主要包括VL-1000A系列紫外交聯(lián)儀（365nm）、VL-1000B系列紫外交聯(lián)儀（302nm）、VL-1000C系列紫外交聯(lián)儀（254nm）、VL-3000系列紫外交聯(lián)儀（三種波長）滿足不同的科研需求。

對每一個特定的結(jié)合蛋白和探針，所用的純化蛋白，部分純化蛋白，粗制核抽提液需作優(yōu)化：一般所用純化蛋白的量在20-2000ng間，可將蛋白:DNA的等摩爾比調(diào)整為蛋白的摩爾數(shù)是DNA的5倍；用粗制核抽提液，需要2-10ug蛋白形成特異的復(fù)合物。

部分純化蛋白與粗制核抽提液應(yīng)保存在-80℃、探針應(yīng)保存在-20℃以防止降解。

無論探針或是結(jié)合蛋白都應(yīng)避免多次凍融。

4、Poly(dI:dC)，非特異性競爭DNA，特異性競爭DNA在EMSA測定中的作用？

Poly(dI:dC)由肌苷和胞嘧啶組成。在EMSA反應(yīng)中加入poly(dI:dC)，可抑制粗制核抽提液中轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子與標(biāo)記探針的非特異結(jié)合。結(jié)合溶液中的poly(dI:dC)的用量需在正式實驗前進(jìn)行優(yōu)化，一般用量大約在0.05mg/ml左右。當(dāng)用純化的蛋白作凝膠遷移反應(yīng)時，不必一定加入poly(dI:dC)，如加入，則普通反應(yīng)中所用終濃度不超過50-100ng。對核抽提液，每2-3ug核抽提液用1 ug poly(dI:dC)。

為確定所形成的復(fù)合物的特異性，在含或不含增量的特異競爭DNA或非特異的競爭DNA時，作結(jié)合反應(yīng)的競爭實驗。一般，特異競爭探針是非標(biāo)記的DNA，其序列與標(biāo)記探針相同，故能與標(biāo)記探針競爭與結(jié)合蛋白的反應(yīng)。非特異競爭探針的長度組成和DNA探針相同，但序列不同。如果結(jié)合蛋白與標(biāo)記探針的結(jié)合被特異競爭探針抑制，而不受非特異探針的影響表明靶結(jié)合蛋白的存在。特異與非特異性競爭DNA的用量也需優(yōu)化或滴定，但競爭DNA通常是標(biāo)記的探針用量的30-100倍（w/w）。

5、用什么凝膠條件將蛋白質(zhì)/探針復(fù)合物和游離的探針分離開？

將結(jié)合蛋白或粗制核抽提液和目的探針結(jié)合，蛋白/探針復(fù)合物和游離探針可在非變性聚丙烯酰胺凝膠中經(jīng)電泳分離。聚丙烯酰胺的濃度一般為6%，在特定條件下可用高或低的濃度。也可將TGE緩沖液（12.5mM Tris，pH8.3，95mM 甘氨酸，0.5mM EDTA）用于不穩(wěn)定的蛋白/DNA復(fù)合物。在4℃進(jìn)行結(jié)合和電泳實驗以阻止不穩(wěn)定復(fù)合物和探針的解離。

當(dāng)帶型不緊密出現(xiàn)拖尾時，表明復(fù)合物存在解離。凝膠必需*聚合，以避免帶型拖尾。如復(fù)合物不進(jìn)入凝膠則表明所用的蛋白或探針過量，或鹽的濃度過量不適用于這一反應(yīng)。在含抽提液的帶中不含游離探針或復(fù)合物，但只含探針的帶中有探針表明抽提物有核酸或磷酸酶污染，應(yīng)在抽提液中和結(jié)合反應(yīng)中加入相應(yīng)的抑制劑。威尼德生物科技（北京）有限公司，使用UVA(365nm)、UVB(302 nm)、UVC(254 nm)三種波長制造了四款紫外交聯(lián)儀，主要包括VL-1000A系列紫外交聯(lián)儀（365nm）、VL-1000B系列紫外交聯(lián)儀（302nm）、VL-1000C系列紫外交聯(lián)儀（254nm）、VL-3000系列紫外交聯(lián)儀（三種波長）滿足不同的科研需求。